Bepaalde cellen, zoals rode bloedcellen en spiercellen, moeten aanzienlijke vervormingen kunnen weerstaan. Bij ziekten waarbij sprake is van kwetsbare membranen, zoals erfelijke sferocytose (dat de rode bloedcellen aantast) en de ziekte van Duchenne (die de spiercellen treft), leiden de vervomingen tot problemen. Om de vervormbaarheid van de cellen en de ontregeling ervan te begrijpen willen we beter inzicht krijgen in de organisatie van de lipiden, vetachtige stoffen die de belangrijkste bestanddelen zijn van de membranen.


Belangen en cellulaire modellen

Bepaalde cellen dwingen hun membraan tot aanzienlijke vervormingen tijdens essentiële fysiologische processen; dat is onder andere het geval bij rode bloedcellen tijdens filtratie door de erg nauwe poriën van de milt, bij spiercellen tijdens spiercontracties, bij bloedplaatjes tijdens bloedstolling, bij de macrofagen tijdens het omsluiten van bacteriën, bij gisten tijdens hun splitsing, etc. Lipiden zijn de belangrijkste bestanddelen van de membranen. In ons onderzoek proberen we inzicht te krijgen in de organisatie van de lipiden om zo de vervormbaarheid van de membranen te begrijpen.

Als model hebben we de rode bloedcel gekozen, één van de eenvoudigste en best gekaraktiseerde menselijke cellen. De rode bloedcel is bijzonder vervormbaar en kan door de nauwe poriën van de milt worden geperst, zelfs meer dan 10 duizend keer in zijn leven. Dat is te danken aan de sterke verankering van het membraan aan het cytoskelet, een eiwitstructuur die zorgt dat de cel zijn vorm behoudt. De stevigheid van deze verankering wordt getest bij elke doorgang door de poriën.

Bij erfelijke sferocytose leidt het gebrek aan vervormbaarheid van rode bloedcellen tot vroegtijdige vernietiging van de cellen in de milt. Dit veroorzaakt bloedarmoede en de chirurgische verwijdering van de milt kan noodzakelijk zijn.

 

Organisatie van de membraanlipiden in domeinen

Lange tijd ging men ervan uit dat de membraanlipiden homogeen, twee-laags verdeeld waren, met uitzondering van zeer kleine, onstabiele domeinen die rijk zijn aan specifieke lipiden (nanometrische lipidenrafts genoemd). Dankzij confocale microscopie met hoge resolutie van levende rode bloedcellen heeft ons team ontdekt dat er veel grotere en stabielere lipidendomeinen bestaan dan de nanometrische rafts. Deze worden nu micrometrische domeinen genoemd. De domeinen hangen af van de temperatuur, de cholesterolinhoud van het membraan, de membraanspanning en de verankering van het membraan in het onderliggende cytoskelet. Deze domeinen zijn sterk aangetast bij patiënten met sferocytose. Onze doelstellingen zijn (i) de interne moleculaire organisatie van deze micrometrische domeinen definiëren; (ii) er de globale moleculaire lipiden- en de proteïnesamenstelling van bepalen; (iii) evalueren hoe ze bijdragen tot de fysiopathologie van de sferocytose.

 

Bijdrage van de membraanlipidendomeinen aan ziekten die het gevolg zijn van de fragiliteit van het membraan

We weten al dat de organisatie van het membraan van rode bloedcellen in de micrometrische domeinen is aangetast bij patiënten met sferocytose. We bekijken twee hypotheses die kunnen verklaren hoe de micrometrische domeinen een impact hebben op de vervormbaarheid van het membraan. De eerste hypothese beschouwt deze domeinen als kwetsbare sites die het afbreken van de abnormale rode bloedcellen bevorderen. De tweede hypothese gaat uit van een membraanreservoir, met daarin de micrometrische domeinen, dat de vervormbaarheid van de rode bloedcellen bevordert. Ons onderzoek zou de fysiopathologie moeten ophelderen van ziekten die te maken hebben met de kwetsbaarheid van de rode bloedcellen en zou preventieve vooruitzichten kunnen bieden voor de hemolyse bij patiënten met sferocytose.

De uitbreiding van ons onderzoek naar de ziekte van Duchenne is voorzien. Ook de spiercel beschikt over een goed gestructureerd cytoskelet dat sterk verankerd zit in het membraan. Dit is essentieel om niet te breken tijdens de spiersamentrekking. Een gebrek aan cellulaire vervorming leidt bij de ziekte van Duchenne tot degeneratie van de spiervezels, die al snel gepaard gaat met spierzwakte en progressieve verlamming.

 

Membrane fluidity and stability are essential for mammalian cells. Until recently, membrane lipids were considered to form homogenous bilayers, except at small domains (short-lived lipid rafts and long-lived caveolae). However, using vital high-resolution confocal imaging, our group discovered that inserted exogenous fluorescent analogs of various membrane lipids or direct labeling of corresponding endogenous lipids using lipid-specific proteins derived from bacterial toxins label larger (micrometric) non-overlapping stable domains (Figs. 1 & 2). These domains depend on temperature, cholesterol, membrane tension as well as membrane:cytoskeleton anchorage, and are altered in spherocytosis, a genetic membrane fragility disease of red blood cells (Fig. 3). To understand the mechanisms underlying biogenesis, control and significance for physiopathology of micrometric lipid domains, our group addresses their (i) relation with lipid rafts; (ii) differential association with membrane proteins (proteomics of red blood cell membrane-derived microvesicles, imaging and screening in yeast); (iii) role for membrane deformability (during red blood cell deformation, yeast budding and migration of a muscular cell line); and (iv) contribution to physiopathology of membrane fragility diseases of red blood cells (spherocytosis) and muscle (Duchenne myopathy). Another part of the project aims at exploring drug activity and toxicity using red blood cells labeled with fluorescent lipids or toxins, as a new simple tool to study drug:membrane interaction. Investigations rely on cell culture, advanced bioimaging methods (live cell high-resolution confocal imaging, high-throughput confocal microscopy, transmission and scanning electron microscopy, dynamics by fluorescence recovery after photobleaching [FRAP], all available at PICT, see below), biochemistry (lipid content and metabolism, subcellular fractionation and lipid rafts extraction) and molecular biology (screening in yeast, proteomics).

Fig. 1

Fig. 2

Fig. 3

Our group works in tandem with the Platform for Imaging Cells and Tissues (PICT). PICT is not only a core facility providing access and training to high-throughput, high-resolution and multiphoton confocal imaging as well as scanning and transmission electron microscopy, but also an established tradition of expertise, advice and collaborations within the DDUV Institute, the health research campus of the UCL, as well as national and international partnerships, both academic and industrial. We are happy to share expertise in scientific projects addressing defined questions which can benefit from: (i) electron microscopy (scanning and transmission), including ultrastructural cytochemistry; (ii) high-resolution and high-throughput confocal microscopy, for live-cell imaging and immunolabelling; (iii) multiphoton microscopy to image tissues and organs for several hours without damage; and (iv) advanced applications by confocal microscopy, including dynamics of molecular movement by Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP), protein dimerization by Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC), in situ detection of free radicals (ROS) at distinct subcellular compartments, and protein:protein interactions by FRET, etc. In addition, we propose advanced images analyses such as deconvolution, 3-D reconstruction, morphometry, objective co-localization, etc.

Complete list on PubMed
Donatienne Tyteca
Institut de Duve
Avenue Hippocrate 75 - B1.75.05
B-1200 Bruxelles
Tel:
+32 2 764 75 91
Fax:
+32 2 764 75 43
Ons Onderzoeksrapport van 2018 is beschikbaar ​"icone" Download