Notre projet consiste à étudier comment un virus peut modifier les réponses immunitaires qui se développent chez son hôte et quelles conséquences ces modifications peuvent avoir sur des pathologies indépendantes de l'infection mais concomitantes à celle-ci.

Les infections virales sont la cause de nombreuses maladies qui peuvent affecter des patients de tout âge, atteindre tous les organes, et conduire à des symptômes variés, à une morbidité importante et parfois au décès des patients. Dans de nombreux cas, la maladie qui se développe est liée au tropisme du virus, c'est-à-dire à sa capacité d'infecter sélectivement telle ou telle population de cellules. Ainsi, un virus qui infecte des cellules du système respiratoire provoquera une bronchite ou une pneumonie, un autre qui s'attaquera aux cellules du foie sera la cause d'une hépatite.

Mais dans certains cas, les mécanismes responsables de la maladie survenant comme conséquence de l'infection sont plus complexes. Les réponses immunitaires mises en place pour éliminer l'agent infectieux peuvent ainsi avoir des effets secondaires néfastes pour l'hôte. De plus, de nombreux virus ont dévelopé la capacité de modifier les réponses immunitaires de leur hôte, soit en déprimant certains aspects de cette défense qui leur sont défavorables, soit, en en activant d'autres qui détournent les défenses de leur action anti-virale. Cette modulation du système immunitaire a pour rôle premier de permettre au virus d'échapper à ces défenses. Cependant, comme les modifications engendrées ne se limitent pas aux réponses anti-virales, elles affectent également l'ensemble du fonctionnement du système immunitaire. Dès lors, toutes les pathologies qui se développent dans l'hôte au moment de l'infection, et dont les mécanismes dépendent plus ou moins du système immunitaire peuvent voir leur cours affecté par l'infection, alors qu'au départ, elles sont totalement indépendantes de celle-ci.

La conséquence de ce mécanisme pathogène différent se situe notament au niveau de la prévention des maladies liées aux infections virales. Dans le cas de pathologies liées spécifiquement à un virus particulier, comme le virus de la variole, celui de la poliomyélite ou encore celui de la grippe, il est possible de protéger la population au moyen de vaccinations qui vont etablir une défense dirigée spécifiquement contre le virus concerné. Dans le cas de modulations du système immunitaire, au contraire, de nombreux virus très différents peuvent avoir le même effet sur les réponses de l'hôte. La vaccination contre l'un d'entre eux ne permettra donc pas de protéger contre les diverses causes qui peuvent conduire à la même pathologie. Dans ce cas, il est donc plus important de comprendre quels sont les mécanismes immunitaires affectés par ces diverses infections, et d'agir au niveau de ceux-ci.

Il est intéressant de constater que, par ailleurs, certaines pathologies peuvent être améliorées par une infection virale concomitante, les modifications des réponses immunitaires ayant ici un effet favorable à l'hôte infecté. Dans ces situations, la compréhension de ces mécanismes peut permettre de définir de nouvelles approches thérapeutiques qui pourront être utilisées, y compris chez les patients n'ayant pas dévelopé d'infection virale.

De manière pratique, l'étude fondamentale des effets d'une infection virale sur le système immunitaire de son hôte nécessite l'utilisation d'animaux de laboratoire. Il serait en effet impensable d'infecter volontairement des sujets humains pour déterminer l'effet des virus sur leurs réponses immunitaires, et la complexité de ce système, les nombreuses interactions qui existent entre les cellules impliquées rendent impossible une étude complète in vitro.

Au laboratoire, nous utilisons un modèle d'infection de souris, un animal dont le système immunitaire est bien caractérisé et proche de celui de l'homme. Le virus concerné se nomme "lactate dehydrogénase-elevating virus", en abrége LDV. C'est un virus qui est bénin pour la plupart des souris mais qui possède la capacité de modifier de manière très importante mais transitoire le système immunitaire de son hôte, ce qui le rend particulièrement approprié à l'étude des pathologies indirectes causées par un agent infectieux qui modifie le micro-environnement immunitaire. L'infection par le LDV résulte en une activation de nombreuses cellules immunitaires, comme les macrophages, les cellules "tueuses naturelles" ou les lymphocytes B qui secrètent les anticorps, mais également en une modification qualitative des réponses d'autres cellules, dont les lymphocytes T auxiliaires et en une suppression de certaines réponses bien particulières.

En utilisant ce virus, nous avons pu observer des effets importants sur certaines maladies induites de manière simultanée chez la souris. Ainsi l'activation des cellules "tueuses naturelles" protège l'animal contre la croissance de certains cancers sensibles naturellement à ce type de cellules. De même les souris infectées par le LDV sont protégées contre le développement d'une maladie très proche de la sclérose en plaques, ou contre certains effets secondaires très dangereux des greffes de cellules immunitaires utilisées dans le traitement de leucémies. La compréhension des mécanismes complexes mis en route par l'infection pourrait nous permettre de mieux comprendre les mécanismes responsables de la gravité de ces pathologies et donc de définir de nouvelles voies d'approche pour leur traitement.

Au contraire, l'infection par le LDV sensibilise fortement les souris à d'autres types de maladies. Ainsi, les animaux ayant reçu le virus développent beaucoup plus rapidement un choc septique, une complication très grave d'infections bactériennes. D'autre part, ils présentent des anémies et des destructions de plaquettes sanguines beaucoup plus importantes en présence d'anticorps dirigés contre ces cellules. Il est possible, par exemple de provoquer chez les souris infectées par le LDV un syndrome clinique très semblable à celui que présentent de jeunes enfants à la suite d'infections virales banales et qui se caractérise par des saignements, le plus souvent heureusement limités, mais qui peuvent parfois atteindre le système nerveux et ont alors un caractère de gravité beaucoup plus important. Les études effectuées chez la souris ont permis de montrer qu'un élément central dans la sensibilisation des animaux à ces pathologies est l'activation des macrophages. Cette activation excessive induite par le virus conduit ces cellules à secréter de grandes quantités de molécules toxiques en réponse à des composants bactériens et à détruire les cellules comme les globules rouges ou les plaquettes sanguines qui ont été fixées par des auto-anticorps. L'analyse des mécanismes aboutissant à l'activation des macrophages lors de l'infection par le LDV nous permettra peut-être de définir comment réduire cette activation excessive. La transposition de ces connaissances aux pathologies humaines pourrait donc ici aussi permettre d'ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques.

 

The possibility for evoluted organisms to survive viral infections depends on the ability of  their immune system to eliminate the infectious agent. Therefore, numerous mechanisms, involving different types of  immune cells such as cytolytic lymphocytes, T helper and B lymphocytes and macrophages, the molecules that allow those cells to communicate, namely the lymphokines, and the products of those interactions, including antibodies, have been elaborated. On the other hand, viral infections strongly modulate the immune microenvironment of the host which often leads to alterations of responses elicited against non-viral antigens and of concomitant diseases with an immune component. Our project is to analyse, in murine models, some aspects of  these relations between viruses and the immune system, with a special interest for the consequences of virally-induced modulations of the immune micro-environment on the course of diseases developing concomitantly to the infection in the host.

 

Viral infections result in a dramatic increase in the proportion of IgG2a

Of particular interest is the fact that all antibody responses are not equal.  Indeed, depending on their isotype, immunoglobulins display various properties, such as differential affinity for receptors expressed on phagocytes. During the last years, we found that the isotype of antibody responses was influenced by concomitant viral infections. The effect of the virus resulted in a dramatic increase in the proportion of IgG2a, not only in antiviral antibodies, but also in immunoglobulins with an antigenic target unrelated to viral proteins. The modulations of antibody responses was analysed with more details by using a model of infection with lactate dehydrogenase-elevating virus (LDV), a common mouse nidovirus that induces strong and early immune responses. We could demonstrate that a dual regulation of antibody responses by gamma-interferon (IFN-γ) and interleukin-6 explains this isotypic bias. IgG2a anti-LDV antibodies were found to be more efficient than other isotypes to protect mice against a fatal polioencephalomyelitis induced by the virus. However, the modification of the isotype of antibodies reacting with self antigens could potentially lead to more deleterious autoimmune reactions. 

 

T helper lymphocyte differentiation

This property of viruses to enhance selectively the production of one immunoglobulin isotype could depend on the preferential activation of a subset of T helper lymphocytes. Indeed, different subpopulations of those cells, called Th1 and Th2, respectively, are distinguished in particular by their capability of producing selectively IFN-γ or interleukin-4, which can selectively trigger B lymphocytes to produce IgG2a or IgG1, respectively. We have found that LDV infection results in a suppression of Th2 responses elicited by immunization with an antigen unrelated to the virus. More recently, other populations of Th lymphocytes, such as Th17 cells that are involved in some autoimmune responses, as well as T regulatory lymphocytes that inhibit ongoing responses have been described. Preliminary observations in our group show a dramatic prevention of diseases such as autoimmune encephalitis and graft-versus-host disease in mice acutely infected with LDV. Whether this protective effect of the virus results from a modulation of T helper/ T regulatory cells remains to be determined.

 

Activation of natural killer cells

Many of the influences that viruses may have on diverse immune responses can be explained by the production of pro-inflammatory cytokines, including IFN-γ. Therefore, our analysis of the relationship between viruses and the immune system has focused on the activation, by LDV, of cells from the innate immune system that are able to secrete this cytokine, namely the natural killer (NK) cells. Within a few days after infection, a strong and transient NK cell activation, characterized by accumulation of this cell population in the spleen, by enhanced IFN-γ message expression and production, as well as by cytolysis of target cell lines was observed. Two pathways of IFN-γ production have been observed that both involve NK cells. The first pathway, found in normal mice, is independent from type I IFN and from interleukin-12. The second pathway involves interleukin-12, but is suppressed by type I IFN. Because NK cells and IFN-γ may participate in the defense against viral infection, we analyzed their possible role in the control of LDV titers, with a new agglutination assay. Our results indicate that neither the cytolytic activity of NK cells nor the IFN-γ secretion affect the early and rapid viral replication that follows LDV inoculation.

Interestingly, NK cell activation results in an increased expression of CD66a (CEACAM-1), an adhesion molecule that display immunoregulatory function on activated T lymphocytes. However, this enhanced expression, that is also found on immature NK cells, results from NK cell stimulation with IL-12 and IL-18, but not with LDV. Therefore, different pathways of NK cell activation, leading to various phenotypes and, probably various functions, may be observed.

 

Activation of macrophages and enhanced susceptibility to endotoxin shock

Activation of cells of the innate immune system by LDV includes also macrophages and leads to an enhanced response to lipopolysaccharide (LPS), and to an exacerbate susceptibility to endotoxin shock.  A synergistic effect of LDV and LPS triggered dramatic production of tumor necrosis factor (TNF) and IFN-γ. Susceptibility to LPS shock was completely mediated by TNF, and partially by IFN-γ. This increased susceptibility of LDV-infected mice to endotoxin shock was not mediated by modulation of the expression of membrane receptors for LPS, but was correlated with increased levels of soluble LPS receptors. In this context, the production of type I IFNs may protect the host against exacerbated pathology by controling the production of IFN-γ.

 

Blood autoimmune diseases

Virally-induced macrophage activation leads also to an enhanced phagocytic activity, with potential detrimental consequences for ongoing autoimmune diseases. LDV infection resulted in moderate thrombocytopenia in normal animals through enhanced spontaneaous platelet phagocytosis. Our analysis was then focused on autoantibody-mediated blood autoimmune diseases.  A new experimental model of anti- platelet response was developed in the mouse. Immunization of CBA/Ht mice with rat platelets was followed by a transient thrombocytopenia and production of autoantibodies that react with epitope(s) shared by rat and mouse platelets. Two IgM anti-platelet monoclonal autoantibodies were further analyzed. They recognized mouse platelet antigens and could induce both platelet destruction and impairment of their function. This response was found to depend on CD4+ T helper lymphocytes reacting with rat, but not with mouse platelets. These anti-rat platelet T helper cells were mainly of the Th1 phenotype. When transferred into naive mice, they enhanced the anti-mouse platelet antibody response induced by subsequent immunization with rat platelets. In addition, depletion of CD25+ cells enhanced the thrombocytopenia induced by immunization with rat platelets whereas adoptive transfer of CD4+CD25+ cells from immunized mice suppressed it. Our results suggest therefore that activation of anti-rat platelet T helper cells can bypass the mechanism of tolerance and result in the secretion of autoreactive antibodies, but this response is still controlled by regulatory T cells that progressively develop after immunization.

We have analysed whether a viral infection could modulate such an autoantibody-mediated autoimmune disease. In mice treated with anti-platelet antibodies at a dose insufficient to induce clinical disease by themselves, infection with LDV or mouse hepatitis virus was followed by severe thrombocytopenia, whereas infection alone, without autoantibody administration led to a moderate disease. Similarly, administration of anti-erythrocyte monoclonal autoantibody to mice resulted in the development of a transient hemolytic anemia that was dramatically enhanced by a simultaneous infection with LDV, leading to the death of most animals. This viral infection induced an increase in the ability of macrophages to phagocytose in vitro autoantibody-coated red cells, and an enhancement of erythrophagocytosis in the liver.

Treatment of thrombopenic or anemic mice with clodronate-containing liposomes and with total IgG indicated that opsonized platelets and erythrocytes were cleared by macrophages. Administration of clodronate-containing liposomes decreased also the in vitro phagocytosis of autoantibody-coated red cells by macrophages from LDV-infected animals. The increase of thrombocytopenia triggered by LDV after administration of anti-platelet antibodies was largely suppressed in animals deficient for IFN-γ receptor. Moreover, LDV infection resulted in an increased expression of receptors recognizing the Fc portion of antibodies, which may at least partially leads towards the enhanced phagocytic activity of macrophages. Together, these results suggest that viruses may exacerbate autoantibody-mediated thrombocytopenia and anemia by activating macrophages through IFN-γ production, a mechanism that may account for the pathogenic similarities of multiple infectious agents. Regulation of macrophage activation results in modulation of autoantibody-mediated cell destruction and may be considered as a possible treatment for autoimmune diseases that involve phagocytosis as a pathogenic mechanism.

Together, these two models may correspond to the development of some auto-immune diseases: a first stimulus triggers the production of autoantibodies, through molecular mimicry. A second stimulus, such as a viral infection, leads to the activation of macrophages and results in the destruction of opsonized target cells.

Jean-Paul Coutelier
Institut de Duve
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