Certaines cellules, comme les globules rouges et les cellules musculaires, imposent à leur membrane des déformations importantes. Des dérèglements de ces déformations sont à la base de maladies de fragilité membranaire telles que la sphérocytose héréditaire (qui affecte les globules rouges) et la myopathie de Duchenne (qui touche les cellules musculaires). Pour comprendre les déformations des cellules et leurs dérèglements, il est essentiel d’élucider l’organisation des lipides, constituants majoritaires des membranes.

Enjeux et modèles cellulaires

Certaines cellules imposent à leur membrane des déformations importantes lors de processus physiologiques essentiels; c’est notamment le cas des globules rouges lors de la filtration à travers les pores très étroits de la rate, des cellules musculaires pendant la contraction musculaire, des plaquettes lors de la coagulation sanguine, des macrophages lors de la capture de bactéries, des levures lors de leur division, etc. Les lipides sont les constituants majoritaires des membranes. L’élucidation de leur organisation est donc indispensable pour comprendre la déformabilité des membranes, dont les dérèglements sont à la base de maladies génétiques de fragilité de la membrane, telles que la sphérocytose familiale qui affecte les globules rouges et la myopathie de Duchenne qui affecte les cellules musculaires.

Notre modèle de prédilection est le globule rouge car il constitue une cellule à la fois simple et bien caractérisée. La membrane des globules rouges jouit d’une déformabilité et d’une résistance remarquables, grâce à un cytosquelette bien structuré et fortement ancré à la membrane. La robustesse de cet ancrage est testée à chaque passage au travers des pores de la rate, càd plus de 10.000 fois dans la vie d’un globule rouge normal. A l’inverse, le manque de déformation des globules rouges dans la sphérocytose héréditaire cause leur destruction prématurée dans la rate, ce qui peut entraîner une anémie sévère, justifiant l’ablation chirurgicale de la rate. La cellule musculaire possède également un cytosquelette bien structuré et fortement ancré à la membrane, essentiel pour la résistance à la rupture lors de la contraction musculaire. A contrario, le manque de déformation cellulaire dans la myopathie de Duchenne cause une dégénérescence des fibres musculaires et s’accompagne très rapidement d’une faiblesse musculaire et d’une paralysie progressive. Notre groupe examine si l’organisation des lipides membranaires joue un rôle dans la déformation des globules rouges et des cellules musculaires.

 

Organisation des lipides membranaires en domaines

On a longtemps considéré que les lipides membranaires étaient distribués de manière homogène, hormis le regroupement de certains lipides particuliers en domaines de très petite taille et instables, appelés radeaux lipidiques nanométriques (les rafts). Grâce à la microscopie confocale à haute résolution de globules rouges vivants, notre équipe a découvert l’existence de domaines lipidiques beaucoup plus grands et plus stables que les radeaux nanométriques, dès lors appelés domaines micrométriques. Ces domaines dépendent de la température, du contenu de la membrane du globule rouge en cholestérol, de la tension membranaire et de l’ancrage de la membrane du globule rouge à son cytosquelette sous-jacent. Ces domaines sont sévèrement altérés chez des patients atteints de sphérocytose. Nos objectifs sont (i) de définir l’organisation moléculaire interne de ces domaines micrométriques; (ii) d’en établir la composition moléculaire globale, lipidique et protéique; (iii) d’évaluer comment ils contribuent à la physiopathologie de la sphérocytose; et (iv) d’étendre nos recherches aux cellules musculaires.

 

Contribution des domaines lipidiques membranaires aux maladies de fragilité de membrane

Nous savons déjà que l’organisation de la membrane des globules rouges en domaines micrométriques est modifiée chez des patients atteints de sphérocytose. Nous envisageons deux hypothèses explicatives d’un impact des domaines micrométriques sur la déformabilité membranaire. La première hypothèse considère ces domaines comme des sites de fragilité, favorisant la rupture des globules rouges anormaux. La seconde hypothèse implique un réservoir de membrane, pouvant inclure les domaines micrométriques, favorisant la déformabilité des globules rouges. Nos recherches devraient éclairer la physiopathologie des maladies de fragilité des globules rouges et pourraient offrir des perspectives préventives de l’hémolyse des patients atteints de sphérocytose. L’extension de nos recherches à la myopathie de Duchenne est prévue.

Membrane fluidity and stability are essential for mammalian cells. Until recently, membrane lipids were considered to form homogenous bilayers, except at small domains (short-lived lipid rafts and long-lived caveolae). However, using vital high-resolution confocal imaging, our group discovered that inserted exogenous fluorescent analogs of various membrane lipids or direct labeling of corresponding endogenous lipids using lipid-specific proteins derived from bacterial toxins label larger (micrometric) non-overlapping stable domains (Fig. 1). These domains depend on temperature, cholesterol, membrane tension as well as membrane:cytoskeleton anchorage, and are altered in spherocytosis, a genetic membrane fragility disease of red blood cells (Fig. 2). To understand the mechanisms underlying biogenesis, control and significance for physiopathology of micrometric lipid domains, our group addresses their (i) relation with lipid rafts; (ii) differential association with membrane proteins (proteomics of red blood cell membrane-derived microvesicles, imaging and screening in yeast); (iii) role for membrane deformability (during red blood cell deformation, yeast budding and migration of a muscular cell line); and (iv) contribution to physiopathology of membrane fragility diseases of red blood cells (spherocytosis) and muscle (Duchenne myopathy). Another part of the project aims at exploring drug activity and toxicity using red blood cells labeled with fluorescent lipids or toxins, as a new simple tool to study drug:membrane interaction. Investigations rely on cell culture, advanced bioimaging methods (live cell high-resolution confocal imaging, high-throughput confocal microscopy, transmission and scanning electron microscopy, dynamics by fluorescence recovery after photobleaching [FRAP], all available at PICT, see below), biochemistry (lipid content and metabolism, subcellular fractionation and lipid rafts extraction) and molecular biology (screening in yeast, proteomics).

 

Figure 1

Legend:
Labelling of endogenous sphingomyelin, cholesterol and ganglioside GM1 by toxin fragments show submicrometric domains. Erythrocytes labelled by fluorescent lysenin (SM, a), theta toxin (cholesterol, b) or cholera toxin B subunit (ganglioside GM1, c).

 

Figure 2

Legend:
Control of submicrometric domains labelled on erythrocytes upon insertion of fluorescent sphingomyelin (BODIPY-SM). (a) control erythrocyte; (b) cholesterol depletion (- 25%); (c) familial spherocytosis.

 

Our group works in tandem with the Platform for Imaging Cells and Tissues (PICT). PICT is not only a core facility providing access and training to high-throughput, high-resolution and multiphoton confocal imaging as well as scanning and transmission electron microscopy, but also an established tradition of expertise, advice and collaborations within the DDUV Institute, the health research campus of the UCL, as well as national and international partnerships, both academic and industrial. We are happy to share expertise in scientific projects addressing defined questions which can benefit from: (i) electron microscopy (scanning and transmission), including ultrastructural cytochemistry; (ii) high-resolution and high-throughput confocal microscopy, for live-cell imaging and immunolabelling; (iii) multiphoton microscopy to image tissues and organs for several hours without damage; and (iv) advanced applications by confocal microscopy, including dynamics of molecular movement by Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP), protein dimerization by Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC), in situ detection of free radicals (ROS) at distinct subcellular compartments, and protein:protein interactions by FRET, etc. In addition, we propose advanced images analyses such as deconvolution, 3-D reconstruction, morphometry, objective co-localization, etc.

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